科研 | Nat. Commun.: BAD通过4E-BP1控制的小鼠和人类模型的局部翻译来调节乳腺生长形态

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编译：微科盟李可爱，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

研究表明探讨非典型蛋白质功能可以识别新的组织稳态途径。本研究中，我们描述了Bcl-2家族成员BAD在乳腺形态发生中的作用。在BAD^3SA敲入小鼠中，BAD不能在3个关键丝氨酸残基上磷酸化，导致青春期腺体发育因导管上皮异常小管的发生而延迟。蛋白质组学和RPPA分析确定BAD可调节局部粘连和mRNA翻译阻遏物4E-BP1。研究结果表明，BAD可调节驱动粘着斑成熟和细胞运动的局部翻译。与此相一致，含BAD^3SA器官内的细胞包含不稳定的突起，其间隔的mRNA翻译和粘着斑减少，伴有细胞迁移和肾小管生成减少，表明稳定性可通过4E-BP1衰竭得以挽救。我们的结果证实了BAD在乳腺发育过程中控制局部翻译和细胞迁移的作用。

论文ID

原名：BAD regulates mammary gland morphogenesis by 4E-BP1-mediated control of localized translation in mouse and human models译名：BAD通过4E-BP1介导的对小鼠和人类模型中局部翻译的控制来调节乳腺生长形态
期刊：Nature Communications
IF：12.121发表时间：2021.05通讯作者：Ing Swie Goping
通讯作者单位：加拿大阿尔伯塔大学

实验设计

实验结果

1.BAD磷酸化参与调节青春期乳腺形态发生
我们用3个基因工程小鼠模型来探讨BAD在出生后乳腺发育中的作用；我们敲除BAD^−/−，敲入BAD^S155A和BAD^3SA,3SA表示内源BAD等位基因S112/136/155处的丙氨酸被取代。本研究中，我们首先描述了BAD蛋白野生型动物乳腺发育过程中的磷蛋白水平。等位基因S112、136和155是协调磷酸化的，我们使用经蛋白质印迹或免疫荧光验证的抗PS112或抗PS136抗体来监测磷酸化的BAD (P-BAD)。总BAD蛋白水平在青春期、未育成年期和退化腺体中相似，在怀孕腺体中升高(图1a)。另一方面，相对于未育成年期，青春期、退化期的P-BAD分别显著升高约26倍、约18倍和约11倍。在细胞水平上，总BAD定位于青春期乳腺的成熟导管和末端芽（TEBs）的上皮细胞，并且在周围的间质中很大程度上未被检测到(图1b)。我们还发现β-氨基丁酸局部富集于四溴二苯醚中(图1c)，这些结果表明P-BAD可调节青春期特定的过程，可能与青春期化有关。图1 BAD在发育中的乳腺中不同程度地磷酸化a，左图:在指定的阶段(青春期5wk、成人12wk、怀孕、更年期)，从BAD^+/+乳腺获得的P-BAD和总BAD的蛋白质印迹。每条泳道都含有来自独立小鼠的裂解物。对照BAD^3SA乳腺裂解物(第一泳道)显示抗pS112-BAD抗体的特异性。黑色箭头突出显示凝胶移位，表明坏磷酸化。中间:相对于CK18加载对照的总BAD定量，显示妊娠期间BAD水平增加，其他阶段水平相似。右图:pS112-BAD相对于总BAD的定量显示成人腺体磷酸化减少，青春期水平最高。数据均为均值SD。每个阶段使用三只独立的小鼠。B，BAD^+/+青春期乳腺的n=3只独立小鼠的代表性免疫荧光图像，用pS136BAD抗体对比总BAD和c P-BAD进行染色。青春期上皮由双层成熟导管组成，被多层TEBs覆盖，显示了同一组织切片中代表成熟导管(上)和胚胎干细胞(下)的区域。总BAD(红色)、pS136-BAD(红色)、F-肌动蛋白(绿色)和DAPI(蓝色)。在所有实验中，BAD定位于上皮细胞。 我们接下来调查了BAD的磷酸突变体是否改变了青春期导管的形态发生。BAD^+/+动物的乳腺在青春期经历显著的生长和延长(比较4wk的青春期开始和5wk的青春期,图2a-c)。然而，BAD^S155和BAD^3SA腺体生长明显延迟，导管延伸、导管面积、初级分支和不一致的分支减少(图2a-c)。研究表明，仅S155突变就足以延迟导管延伸，尽管三种丝氨酸的突变都产生最强的表型。在青春期前、成年、怀孕和更年期的所有其他阶段，BAD3腺泡形态正常。这些结果强调了BAD3有助于青春期乳腺发育，动物在任何阶段都没有表型差异，表明非P-BAD的显性效应(图2a-c)。因此，青春期特异性信号诱导 BAD 的磷酸化并在 Bad^3SA 和 Bad^S155A 动物中阻止这种磷酸化，干扰导管形态发生。 2.BAD^3SA介导的缺陷是上皮细胞自主的
导管的形态发生是通过上皮细胞和基质细胞之间的复杂信号来协调的。由于小鼠是整体遗传模型，我们将一种基因型的上皮移植到另一种基因型的透明脂肪垫中，以确定缺陷的来源(图2d-f)。BAD^+/+上皮移植到BAD^+/+或BAD^3SA腺中，受体脂肪垫以相同的效率和相似的导管扩张重新填充(图2f-h)，表明BAD^3SA腺具有生长能力。相比之下，BAD^3SA表皮在BAD^+/+受体中不能生长(图2f，g)，证明缺陷存在于BAD^3SA表皮中(图2g；χ2p= 0.0235)。图2 Bad^3SA 显示来自上皮细胞的青春期乳腺发育缺陷
a，一个典型的胭脂红染色的乳腺整体标本显示BAD突变体的青春期形态发生,图片显示了BAD^+/+(n=6)、BAD^−/−(n= 6)、BAD^S155A(n=6)和BAD^3SA(n=7)的5wk小鼠乳腺。为了进行比较，在4wk(左侧，n=7)时的BAD^+/+腺体对照代表青春期早期发作。上皮支(暗粉色分支结构)嵌入乳腺脂肪垫(围绕浅粉色基质)。b、c，不同发育时期(5wk、8wk、>40wk)BAD^+/+、BAD^−/−_、BAD^S155A和BAD^3SA在上皮支形态特征定量。b)上皮支延伸的定量显示在5wk时BAD^S155A(灰色)和BAD^3SA(蓝色)的延迟；c)上皮支面积的定量显示5wk时BAD^S155A(灰色)和5wk和8wk时BAD^3SA(蓝色)的面积减少。d，显示受体小鼠脂肪垫清除和随后供体组织移植的移植试验示意图。移植手术后6或7周评估供体组织生长。未接受移植的阴性对照“受体”小鼠(每种基因型5只小鼠)的代表性胭脂红染色显示了脂肪垫清除的效率。f实验移植系列的典型胭脂红染色(每种移植条件下n=5只小鼠)。红色代表供体组织基因型，蓝色代表受体基因型。g.成功移植再填充的清除脂肪垫的百分比显示BAD^3SA上皮细胞未能再填充脂肪垫。h在BAD^+/+或BAD^3SA脂肪垫中，对移植BAD^+/+上皮细胞所占面积的定量显示了相似的再增殖面积。
我们使用离体3D器官型分支试验直接检测上皮效应，该试验使用从小鼠乳腺分离的原代小鼠器官上皮细胞样物质。这些初级小鼠器官样细胞被包埋在基质凝胶:胶原蛋白-1的细胞外基质模拟物中，在那里它们形成类似于TeB的多细胞包囊，并参与导管形态发生(图3a)。BAD在这些分支器官中表达并磷酸化。显微镜显示BAD^3SA主动脉瓣产生相似比例的具有分支的器官样结构，但是分支延伸明显较慢和器官样结构的分支数量较少(图3b–d)。因此，BAD^3SA主动脉等表现复制了导管延长延迟并证实了上皮特异性缺陷。为了建立一个遗传易处理的系统并研究人类细胞的保存，我们使用了MCF10A，不具有3D管状基因的特征性模型的转化乳腺细胞系。当在3DMatrigel:Collagen-I 中生长时，MCF10A 形成多细胞囊肿，其中边缘的细胞将突起延伸到细胞外基质中，并开始集结细胞迁移以产生导管，与乳腺导管形态发生同义(图3e)。我们敲除了内源性BAD的表达，并异位表达人野生型BAD或BAD^3SA，所有实验都与亲代MCF10A细胞的对照一起进行(图3f)。BAD^3SA在小管延伸较慢的管状囊肿的整体形成中显著受损(图3g-I)。总之，BAD^3SA抑制小鼠导管延长，在3D人细胞小管发生模型中具有保守效应。图3 3D组织类器官分支和 MCF10A 肾小管发生分析显示不可磷酸化的 BAD可产生缺陷
a，3D小鼠器官样分支分析示意图。EGF，表皮生长因子；FGF-2，碱性成纤维细胞生长因子。b，BAD^+/+(上)和BAD^3SA(下)有机样分支分析的代表性亮场延时图像。BAD^+/+中n=150个有机化合物，BAD^3SA中n=185个有机化合物。红线突出用于定量测量的单个分支。c、d， 每个器官分支数量的定量。数据表示为BAD^+/+(橙色)和BAD^3SA(蓝色)有机化合物之间的箱线图，e，显示BAD^3SA(蓝色)器官中的分枝长度减少。BAD^+/+n=150个有机化合物，BAD^3SAn=185个有机化合物。f.3D MCF10A微管生成分析示意图。左:蛋白质印迹显示在正常MCF10A(亲代)和WT细胞中的总BAD^3SA、pSBAD112和pSBAD136。从3D小管生成分析制备裂解物。黑色箭头突出显示凝胶移位，表明BAD磷酸化。右图:蛋白质印迹定量。g三个独立实验的3D 导管发生试验的代表性延时图像MCF10A(上)、WT(中)和BAD^3SA(下)。有分支的囊肿的百分比。h.图基箱线图显示3SA(蓝色)中分枝孢囊的比例降低。图基箱线图显示小管长度在BAD^3SA(蓝色)中减少,收缩表示中间值，凹口表示95%置信区间。 3.BAD^3SA腺苷脱氨酶信号与细胞运动有关
为了深入研究BAD^3SA腺苷脱氨酶信号与细胞运动的关系，我们进行了质谱蛋白质组筛选，比较了5wk-BAD^+/+、5wk-BAD^3SA和4wk-BAD^+/+乳腺。我们首先验证BAD^3SA基因的蛋白质组特征是否反映了青春期的延迟。聚类分析表明，来自5wk-BAD^3SA组织的蛋白质谱更接近4wk，而不是管理匹配的5wk-BAD^+/+小鼠。此外，蛋白质谱的总体最佳聚类数是5wk-BAD^3SA，基于机器学习集成的随机森林分析将5wk-BAD^3SA散点图分类为4wk-BAD^+/+。最后，基因本体(GO)富集分析在5wk-BAD^+/+vs 4wk-BAD^+/+和5wkBAD^+/+vs 5wk-BAD^3SA之间产生惊人相似的分子功能和细胞功能谱。因此，BAD^3SA的蛋白质组谱证实了青春期延迟表型(见图2)。为了识别被BAD^3SA改变的细胞过程，我们分析了分子功能“肌动蛋白结合”和细胞成分“局灶性粘附”的显著变化，表明BAD^3SA破坏细胞迁移过程。新生突起需要肌动蛋白和局部粘连才能转变成稳定的突起，然后连接到细胞外基质并促进细胞生长活动性。为了测试BAD^3SA是否破坏了这一过程，我们在3D小管生成的第3天分析了细胞突起动力学。图4显示了多细胞囊肿边缘的细胞如何延伸和收缩突起进入细胞外基质(图4a)。在局部粘附成熟时，这些突起稳定并促进集体细胞迁移以形成小管(图4a)。表达MCF10A WT和BAD^3SA的囊肿同样擅长形成新生突起(图4b)，然而，BAD^3SA突起明显不太稳定和较短，揭示了粘附稳定性的缺陷(图4c)。新生粘连需要肌动蛋白聚合成熟为稳定的局部粘连，为细胞迁移提供牵引力。事实上，BAD^3SA细胞突起对于丝状肌动蛋白和粘附衔接蛋白都是缺乏的(图4d，e)。相比之下，WT突起显示出强的肌动蛋白染色和蛋白点状定位，表明标记突起稳定的成熟局灶性粘连(图4d，e)。BAD^3SA并不减少多细胞囊肿内体细胞的蛋白和肌动蛋白染色(图4e)，这表明3SA特异性减少了局部的蛋白质积累。 图4 来自 3SA 的 3D MCF10A 囊肿具有不稳定的突起
a，三个独立实验的早期3D小管形成试验中WT(上)和3SA(下)MCF10囊肿的代表性延时图像。单个亚细胞突起要么随着时间延长(红色箭头)，要么不稳定并缩回(绿色箭头)。b，在WT和3SA之间，产生新生突起的细胞囊的百分比没有差异。c，单个突起的长度和寿命显示为散点图。定量显示3SA(蓝色)中突起长度缩短(上)和突起寿命缩短(下)。d，来自WT(上)和3SA(下)早期小管形成试验(第4天)的囊肿代表性免疫荧光图像。DAPI突出了多细胞囊肿中的细胞核，以及突起中细胞核的缺失或存在。插图代表虚线框指示的放大区域。青霉素通道中的洋红色箭头指向病灶粘连斑块。e.图基箱线图，显示了囊肿内细胞(囊肿)或亚细胞突起(突起)中归一化肌动蛋白(左)或桩蛋白(右)荧光强度的定量。下面是带有亚细胞突起的多细胞囊肿的示意图。
4.BAD^3SA转染不依赖于细胞凋亡
BAD^3SA已被证明可诱导凋亡，因此我们检查了凋亡信号是否介导突起缺陷。正如预期的那样，在青春期乳腺的TeB中我们检测到裂解的半胱天冬酶3，但在BAD^3SA中没有显著增加。此外，用半胱天冬酶抑制剂zVAD-fmk阻断半胱天冬酶活性并不能挽救BAD^3SA细胞凋亡检测中的突起缺陷。BAD通过结合抗凋亡Bcl-XL43刺激细胞凋亡。虽然BH3在3D培养系统中与BclXL强烈结合，但破坏与拟BH3 ABT-7的相互作用不会改变BH3抑制突起稳定性的能力。因此，BAD^3SA抑制导管延长的机制不需要Bcl-XL相互作用或caspase活性，并且独立于凋亡。 5.BAD^3SA腺病毒感染不会改变上皮细胞谱系
我们接下来测试BAD^3SA是否代表上皮细胞谱系或干细胞样细胞的比例。为了检查上皮细胞谱系，我们对原代小鼠乳腺上皮细胞进行表面标记CD24和CD49f染色。腔上皮或基底上皮亚型的水平或比例没有显著差异。我们接下来用标记物EpCAM和CD49f检测上皮干/祖细胞池，以确定乳腺干细胞。基因型之间的MRU没有差异。因此，BAD^3SA腺病毒感染不会改变上皮细胞谱系。 6.BAD^3SA BP1过度磷酸化
为了从分子角度了解BAD^3SA解除调控的新途径，我们进行了反相蛋白阵列(RPPA)抗体筛选。通过定量癌症和发育途径的关键调节因子的蛋白/磷蛋白水平，我们发现BAD在4wk和5wk BAD^+/+腺体中均被磷酸化，但在BAD^3SA中未被磷酸化，(图5a，b)。与质谱结果类似，无监督的层次相关聚类分析和随机森林分类显示了5wk-BAD^3SA和4wk-BAD^+/+腺体之间更紧密的比对，证实BAD^3SA赋予发育延迟。方差分析和Tukey-Kramer多重比较分析用于确定所有组之间的显著差异。对显著不同的途径进行分析确定“局灶性粘附-PI3K-Akt-mTOR”为最丰富的表达信号途径，证实BAD^3SA破坏局部粘附过程。在年龄匹配的BAD^+/+和BAD^3SA(p值< 0.01)之间的8种最显著不同的蛋白质/磷蛋白中，前3位mTOR、4E-BP1和eIF4E(图5a，b)都是排名靠前的PI3K-Akt-mTOR途径的标记。由于mTOR、4E-BP1和eIF4E是mRNA翻译的调节剂，这些结果表明BAD在这一途径中起着重要作用。mTORC1激酶复合物可通过磷酸化和抑制翻译阻遏4E-BP1来刺激mRNAs的翻译。在其磷酸化状态下，4E-BP1结合帽结合蛋白eIF4E，阻断eIF4G的后续募集，eIF4g是形成起始复合物eIF4F所必需的。mTORC1在T70和S65依次磷酸化4E-BP1，产生过度磷酸化状态，导致eIF4E的释放，从而允许eIF4F复合物的组装和翻译起始。我们验证了RRPA对独立收集的乳腺组织裂解物和鼠器官样细胞或人MCF10A细胞的3D培养物的过程。研究显示，mTOR差异并不一致(图5b–e)，然而，mTORC1下游靶点4E-BP1的失调在所有模型中都得到证实(图5b–e)。与4wk和5wk-BAD^3SA相比，4E-BP1在正常5wk青春期腺体中显著过度磷酸化(图5d)。这表明被BAD^3SA阻断后，乳腺腺体生长在青春期时期对翻译依赖增强。表达小鼠器官样细胞和MCF10A的原代BAD^3SA细胞裂解物小管也具有降低过度磷酸化4EBP1 的作用(图5e)。为了确认 RPPA 的非显着结果，我们发现总的和活跃的 AKT 和 ERK1/2 激酶没有差异，这两者都有助于 mTORC1 激活和乳腺形态发生。总之，表达 BAD^3SA 的乳腺上皮细胞具有升高的低磷酸化4E-BP1种类，通过低磷酸化4E-BP1和 eIF4E之间的抑制性复合物形成预测翻译抑制。图5 RPPA筛选鉴定在BAD^3SA中改变的分子标记
a，不同青春期阶段(4wk对5wk)或不同基因型(BAD^+/+对BAD^3SA)之间乳腺蛋白和磷蛋白差异的火山图。x轴是组间的折叠变化，Y轴是组间Tukey-Kramer预测的Log2调整后的p值。b，根据5wk BAD^+/+(橙色)和BAD^3SA(蓝色)之间的差异，总/磷酸蛋白点击量按显著性顺序(条形图上从左到右)进行排序。c，蛋白质磷酸化种类的比例。d，顶部:由RPPA鉴定的顶部差异表达的总/磷酸蛋白的乳腺裂解物的蛋白质印迹。验证裂解物由乳腺产生，独立于RPPA样品。黑色箭头突出显示凝胶移位，表明BAD磷酸化。底部:相对蛋白质水平的定量验证了pS112BAD和pS65-4E-BP1在BAD^3SA(蓝色)中显著降低。e，顶部:来自小鼠3D分支器官样裂解物的蛋白质印迹，探测在(b)中鉴定的顶部总/磷蛋白。裂解物是从第6天的器官样分析中制备的。底部:相对蛋白质水平的定量显示BAD^3SA(蓝色)降低了pS112BAD，降低了pS65-4E-BP1，增加了总4E-BP1的水平。 7.BAD^3SA干预4E-BP1相互作用和定位
次磷酸化4E-BP1通过结合eIF4E和阻断eIF4G的募集来抑制翻译，eIF4E的募集通常是随后eIF4F形成和翻译起始所必需的。为了检查3SA是否破坏正常的eIF4E蛋白相互作用，我们使用m7GTP-cap下拉试验来分离与cap结合的eIF4E。与亲代MCF10A和WT相比，在表达3SA的细胞中，与eIF4E相关的4E-BP1增加，与eIF4G相关的减少(图6a)。由于3SA诱导突起特异性缺陷，我们接下来评估4E-BP1或eIF4E是否不同地定位于突起。多细胞包囊和亚细胞突起内的体细胞在WT和3SA中都显示出相似水平的总eIF4E和4E-BP1(图6b)；然而，过度磷酸化的4E-BP1 是差异表达的。它在两种基因型之间的体细胞中表达相似，但有趣的是，高磷酸化的4E-BP1在3SA突起中显著减少(减少约2倍)。因此，3SA突起富含与eIF4E结合的次磷酸化4E-BP1，并阻止eIF4G的募集。总之，这些结果表明3SA抑制突起内的局部基因翻译。 8.BAD^3SA抑制定位的基因翻译，降低突起稳定性和细胞运动性
细胞迁移需要调节信号分子和细胞骨架/粘附蛋白在细胞突起部位的分区组装。这种空间组织的大部分是由定位的基因翻译驱动的。鉴于我们观察到肌动蛋白和蛋白的前突特异性缺失(图4d，e)，我们假设3SA破坏了运动所需的局部翻译。为了测试3SA是否真的减少翻译，我们在小管的3D生长模式分析中评估了蛋白质合成。我们使用翻译的表面传感，将嘌呤霉素掺入生长的多肽链中，产生截短的嘌呤霉素化肽，用抗体显现。BAD^+/+3D原代小鼠器官样培养物相对于器官样体内的细胞而言，在分支延伸区域具有显著增加约2倍的纯化肽染色。BAD^3SA主动脉样分支中的这种局部蛋白质合成减少。亲本和WT MCF10A细管在细管伸长区域的平移升高，而在3SA突起中显著降低(图6c)。为了支持区域效应，全局翻译不受3SA的影响。此外，双顺反子荧光报告分析显示3SA减少了突起中的依赖和非依赖翻译。因此，在原代小鼠和人细胞系3D器官样分析中，基因翻译在导管/小管延伸的局部区域富集，并且这被BAD^3SA抑制。 图6 来自3SA的3D MCF10A囊肿具有缺陷的局部mRNA翻译
a，左图:m7GTP下拉试验示意图，用于评估eIF4E与4E-BP1或eIF4G的相互作用。中间:来自亲本、WT、3SA的MCF10A 3D小管裂解物(第7天)的代表性蛋白质印迹显示eIF4E、4E-BP1和eIF4G(输入)的水平。右图:定量显示从m7GTP下拉菜单中恢复的4E-BP1或eIF4g/eIF4e的比率。3SA(蓝色)显示4EBP1增加，eIF4G与eIF4E的相互作用减少。b，上图:WT和3SA囊肿突起的代表性免疫荧光图像，在早期小管形成试验中(第3天)，用抗eIF4E(绿色)、抗4E-BP1或抗pS65-4E-BP1(红色)和DAPI(蓝色)染色。放置青色线以勾勒亚细胞突起，随后进行定量分析。底部:图基箱线图，显示了囊肿或亚细胞突起中标准化eIF4E、4E-BP1和pS65-4E-BP1标准化荧光强度的定量。只有pS65-4E-BP1显示染色减少，特别是在3SA的突起中。WT和3SA在囊肿和突起中显示相似的eIF4E和4E-BP1染色。c，顶部:3DMCF10A小管发生试验的代表性免疫荧光图像，在培养物中用嘌呤霉素处理，然后进行免疫荧光处理，并用抗嘌呤霉素(红色)、鬼笔环肽(肌动蛋白，绿色)和DAPI(蓝色)染色。底部:归一化囊肿和突出物嘌呤霉素强度的Tukey箱线图显示BAD^3SA(蓝色)中嘌呤霉素染色减少。来自三个独立实验的亲本n=57，WT n=63，3SA n=60。对于图基箱线图，，收缩表示中间值，凹口表示95%置信区间。
9.4E-BP1抑制突起稳定
如果3SA依赖的运动缺陷确实是由于翻译抑制，那么4E-BP1的下调应该挽救该缺陷。为了测试这一点，我们在WT和3SA MCF10A细胞系中进行了稳定的4E-BP1敲除(图7a)，并进行3D小管的生长时间评估分析。3SA新生亚细胞突起的寿命比WT细胞短得多，这一点可以通过4E-BP1敲除法完全挽救(图7b，c)，证明3SA通过4EBP1破坏突起的稳定性。4E-BP1敲除增加了3SA和WT细胞的突起稳定性，使得几乎所有的囊肿在时间过程结束时都具有稳定的突起(图7f)。这些稳定的突起不能伸长，也不能形成管(图7c–e，g)。这表明4E-BP1不仅在表达3SA的细胞中破坏突起的稳定性，而且在正常对照新生突起中也是如此。因此，4E-BP1阻断了从新生突起到稳定突起的转变。3SA通过促进4E-BP1次磷酸化抑制突起稳定，从而支持4E-BP1阻断翻译和突起延长的能力。 图7 3SA介导的突起缺陷和微管形成依赖于4E-BP1
a,顶部:典型的蛋白质印迹评估稳定表达4E-BP1 shRNA的MCF10A WT和3SA细胞系中4E-BP1水平。裂解物是从不表达shRNA(-)、对照非特异性shRNA (+ Ctrl shRNA)或4E-BP1 shRNA (+ 4E-BP1 shRNA)的指示细胞系的3D小管发生分析中产生的，并对印迹进行4E-BP1和eIF4E的探测。底部:定量显示表达4E-BP1 shRNA的裂解物(4E-BP1 shRNA)中4E-BP1蛋白水平降低。b,具有代表性的延时图像，用于WT(上2图)和3SA(下2图)细胞的3D小管发生分析，具有对照敲除(Ctrl shRNA)或4E-BP1敲除(4E-BP1 shRNA)。成像开始于小管形成试验的第3天。插图中的黄色数字表示成像过程中的时间点(小时)。红色箭头表示稳定突起，绿色箭头表示不稳定突起。c,对平均突起寿命的定量分析表明，4E-BP1敲除(蓝色+4E-BP1shRNA)挽救了3SA-不稳定的突起。d,平均突起长度的定量显示4E-BP1敲除降低了WT和3SA(橙色和蓝色+4E-BP1 shRNA)中的突起长度。e,在出生后第7天(上图)或第3SA(下图)进行的3D小管发生分析的代表性亮场图像，形成的微管结构不表达shRNA、Ctrl shRNA或4E-BP1shRNA。随着时间的推移，囊肿分支的百分比为WT(红色)或3SA(蓝色)。f，线图(平均标准差)显示3SA介导的低百分比分支囊肿通过4E-BP1敲除增加(蓝色实线)。4E-BP1敲除法(红色实线)也增加了WT中分枝孢囊的百分比。g，线形图显示4E-BP1敲除减少了WT 3D小管的平均小管长度(红色实线)。

讨论

我们的数据确定了BAD磷酸化和局部mRNA翻译在乳腺发育中的意外作用。我们提出了一种工作模型，即在青春期，导管上皮细胞通过翻译抑制剂 4E-BP1 的局部磷酸化/失活来刺激区室化翻译。非P-BAD (BAD^3SA) 阻止 4E-BP1 的这种过度磷酸化，使得低磷酸化的4E-BP1结合并抑制eIF4E介导的翻译，这抑制了粘着斑成熟、细胞突起稳定性、细胞运动性和最终乳腺形态发生所需的局部翻译（图8）。虽然非P-BAD敲入小鼠(BAD^3SA)延迟了乳腺青春期的发育，但BAD敲入动物在表型上是正常的。事实上，即使在妊娠晚期、哺乳期和更年期乳腺中BAD表达上调，我们的研究其他研究表明敲除的乳腺在表型上是正常的。因此，我们的研究表明P-BAD是相对惰性的，而非P-BAD (BAD^3SA)的强制表达具有主导作用。这可能与体内进行研究相关，因为BAD明显影响青春期发育，这是野生型BAD正常磷酸化的阶段。野生型β-BAD定位于TEB，TEB是出现在青春期并在成年期退化的结构。因此，在青春期后的乳腺中，当细胞迁移停止时，BAD不被磷酸化。因此，BAD通常在青春期被磷酸化，被动地允许细胞在TEB中迁移。BAD^3SA中它的非磷酸化对应物有效地阻止了迁移。BAD^3SA有助于青春期发育，但不能完全阻断导管的形态发生。这表明细胞利用代偿机制来实现运动。事实上，其他基因研究显示了类似的短暂青春期延迟，这些目标基因属于受BAD^3SA影响的信号通路。举例来说，青春期延迟表型出现在mTORC1的体内耗竭研究中，这与我们的模型相一致，其中BAD^3SA是mTORC1的关键靶点，即4E-BP1。导管青春期延迟在乳腺中也有报道，暗示BAD磷酸化是FGFR信号的下游。这与我们的研究一致，因为FGF在原代小鼠3D器官样培养物中诱导小管形成，并且小管形成被BAD^3SA阻断。此外，FGFR信号对青春期激素雌激素和孕激素有反应，为BAD^3SA的青春期特异性效应提供了解释。此外，sharpin的基质损耗也导致BAD^3SA现象。在这种情况下，sharpin损失减少发动机控制模块胶原蛋白僵硬，整合素信号减弱。我们推测，通过减少局部粘附成分如桩蛋白和肌动蛋白的翻译，BAD^3SA同样会损害整合素的功能。显然，我们的数据将一个新的BAD/4EBP1轴整合到已知的乳腺形态发生的分子途径中。我们证明了非磷腺苷酸通过干扰基因翻译来抑制青春期发育。翻译由激酶复合体mTORC1控制，mTORC1功能丧失诱导类似的短暂青春期乳腺延迟。因此，我们评估了BAD^3SA是否抑制mTOR。虽然BAD^3SA在3D器官样体降低了总的和P_S2448 mTOR水平(图5e)，但这些差异在整个乳腺或MCF10A3D小管中都没有概括(图5d)。此外，mTORC1下游靶p70-S6K在任何实验模型中都没有不同程度的磷酸化(图5d，e)，表明mTORC1不是BAD^3SA转染的靶。另一方面，BAD^3SA持续破坏翻译抑制剂4E-BP1的调节性磷酸化；4E-BP1也通过T37、T46和S65的顺序磷酸化由mTORC1经典调节。值得注意的是，4E-BP1 (T37/ 46)的磷酸化在基因型之间没有差异，再次排除了mTORC1的直接作用；相反，BAD^3SA仅在其过度磷酸化位点特异性阻断4EB 1(S65)。综上所述，这些结果表明BAD^3SA调控mTORC1下游或独立于MTorC 1的4E-BP1。在一个潜在的类似场景中，RhoE通过抑制S65上4E-BP1的磷酸化来调节NIH3T3细胞的肌动蛋白和局部粘附组装，而不依赖于mTOR68。因此，虽然mTOR/4E-BP1轴已被很好地确立，但4E-BP1激酶和磷酸酶可能受BAD3SA调节。候选P-S65_4EBP1激酶包括GSK3β、ERK1/2、PIM2、p38MAPK、CDK1和CDK2，虽然 Bad^3SA 乳腺裂解物显示其中 3 种激酶（GSK3β、CDK1 或 ERK1/2）的调节位点磷酸化没有差异，但目前尚不清楚其他未探索的激酶或磷酸酶的贡献。事实上，这可能解释了为什么在某些癌细胞中，4E-BP1磷酸化不受mTOR抑制剂的影响。BAD^3SA抑制4EBP1过度磷酸化的机制在这一点上是推测性的。非PBAD定位于线粒体并增强线粒体代谢和乳腺的GO分析从该研究中，确定线粒体和ATP合酶活性在BAD^3SA统计中有差异。线粒体代谢的改变可能还会影响对蛋白质合成至关重要的氨基酸代谢。有趣的是，亮氨酸缺失减少了与次磷酸化4E-BP1相关的基因翻译，因此，我们需要进一步的研究来阐明非P-BAD调节线粒体代谢的分子相互作用，以及这是否改变了青春期乳腺上皮细胞迁移中4EBP-1的磷酸化。BAD^3SA破坏青春期乳腺发育并改变细胞迁移。虽然干细胞对乳腺形态发生至关重要，但BAD^3SA干细胞似乎不会影响干细胞/祖细胞库。BAD^3SA不改变具有单个干细胞再生功能性乳腺的MRU。这些磁共振成像作为末端芽上皮细胞和肌上皮细胞的来源，与此相一致，BAD^3SA乳腺也具有正常的细胞谱系比例。因此，BAD^3SA代表上皮谱系调控下游的形态发生过程。由于上皮细胞运动性对导管延长也很重要，BAD^3SA介导的细胞运动性缺陷可能是发育延迟的原因。在细胞运动的过程中，局部翻译在前导突起处有效地积累新合成的蛋白质。抑制这种局部翻译会破坏新生突起的稳定性，降低2D病患者的细胞活力。对细胞迁移至关重要的局部翻译产物包括肌动蛋白聚合和粘附复合物的调节剂。事实上，肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白的局部富集是乳腺上皮管集体伸长所必需的。与此相一致，我们的质谱蛋白质组筛选鉴定了青春期诱导的肌动蛋白结合蛋白和局灶性粘附蛋白的差异蛋白表达，并且我们验证了F-肌动蛋白和蛋白的BAD^3SA蛋白表达减少。特别是，β-肌动蛋白基因在病灶粘连附近局部翻译，有趣的是，新合成的β-肌动蛋白优先用于病灶粘连成熟。虽然整体β-肌动蛋白对帽依赖翻译干扰不太敏感，但最近有研究证明这是细胞类型和应激依赖的。事实上，在轴突导向期间，局部β-肌动蛋白翻译与局部4E-BP1过度磷酸化相关。β-肌动蛋白局部翻译的破坏降低了细胞突起的稳定性，降低了局部粘附的成熟，并抑制了细胞的运动性，这类似地描述了BAD^3SA蛋白型，表明乳腺上皮细胞的迁移需要β-肌动蛋白的分区蛋白质合成。当然，β肌动蛋白不是唯一有助于细胞运动的局部翻译的mRNA。对MDA-MB-231乳腺癌细胞中细胞突起的全面筛选和基因/蛋白质定量表明，许多肌动蛋白相关蛋白基因在突起处翻译，包括Arp2/3和actin等，这些蛋白质也在 Bad^3SA 乳腺中耗尽，与3D MCF10A小管生成试验不同，3D原代小鼠器官样培养不依赖于局部粘连进行迁移。这些管中的伸长是由迁移细胞的插入驱动的，细胞间隔化的Ras-PI3K活化和F-肌动蛋白聚合导致突出。这是否依赖于局部翻译尚不清楚，尽管我们认为可能是这样，因为我们确实观察到BAD^3SA3D类器官中失调的4E-BP1磷酸化和局部翻译。因此，局部翻译可能有助于乳腺导管延长期间的体内细胞运动，我们的研究表明这是由BAD^3SA调节的。总之，这些结果表明BAD^3SA是青春期腺体发育的调节剂，影响局部的mRNA翻译和细胞迁移。当导管广泛迁移时，BAD^3SA通常在青春期乳腺中磷酸化，但是在未生育的成人体内没有磷酸化。BAD^3SA磷酸化在乳腺癌发生中是否异常激活，可能促进转移，目前尚不清楚。总之，这项研究提供了一个框架，可以用来询问正常和肿瘤性乳腺过程，并将BAD^3SA的翻译作用与乳腺发育和癌症病理生理学联系起来。图8 BAD 在正常青春期乳腺发育中的作用示意图
BAD 通常在青春期乳腺中磷酸化，使4E-BP1过度磷酸化和随后局部翻译上调，以实现有效的细胞迁移和上皮细胞延伸。 防止 BAD 磷酸化 (3SA) 抑制 4E-BP1 的过度磷酸化，从而损害细胞迁移和延伸。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34011960/

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